電泳設(shè)備技術(shù)的現(xiàn)狀

添加時間：2016/10/5 13:57:00

早期的電泳設(shè)備技術(shù)是由瑞典Uppsala大學(xué)物理化學(xué)系Svedberg教授提出了荷電的膠體顆粒在電場 中移動的現(xiàn)象稱其為電泳。于1937年，收ArneTiselius教授——諾貝爾獎金獲得者，利用些電泳現(xiàn)象，發(fā)明了早期的界面電泳，用于蛋白質(zhì) 分離的研究，開創(chuàng)了電滬泳技術(shù)的新紀(jì)元。此后，各種電泳技術(shù)及儀器相繼問世，先進(jìn)的電泳儀和電泳技術(shù)的不斷發(fā)展，使它在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 技術(shù)中占重要地位，按電泳的原理有三種形式的電泳分離系統(tǒng)：原則上按電泳的原理來分，即移動界面電泳、區(qū)帶電泳和穩(wěn)態(tài)電泳或稱置換（ 排代）電泳。在自由移動界面電泳，是帶電分子的移動速率通過觀察界面的移動來測定，該方法已成為歷史。代之以采用支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳 。
　　區(qū)帶電泳因所用支持體的種類、粒度大小和電泳方式等不同，其臨床應(yīng)用的價值也各有差異。固體支持介質(zhì)可分為兩類：一類是濾紙、醋 酸纖維素薄膜、硅膠、礬土、纖維素等；另一類是淀粉、瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。由于它們具微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故除能產(chǎn)生電泳作用外 ，還有分子篩效應(yīng)，小分子會比大分子跑得快而使分辨率提高。它的優(yōu)點(diǎn)是幾乎不吸附蛋白質(zhì)，因此電泳無拖尾的現(xiàn)象。低濃度的瓊脂糖 電泳相當(dāng)于自由界面電泳，蛋白質(zhì)在電場中可自由穿透，陰力小，分離清晰，透明度高，能透過200～7000nm波長的著色區(qū)帶的檢測敏感性，為 此第一類支持介質(zhì)現(xiàn)已被第二類支持介質(zhì)所替代。
　　穩(wěn)太電泳或稱置換電泳的特點(diǎn)是分子顆粒的電泳遷移在一定時間后達(dá)到穩(wěn)態(tài)，如等電聚焦和等速電泳。
　　區(qū)帶電泳是臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛的技術(shù)，有重要臨床意義，尤其是其他新技術(shù)，更擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，提高了檢測技術(shù)，現(xiàn)對該技 術(shù)的現(xiàn)狀與發(fā)展作一評述。
　　一、正確解釋電泳結(jié)果，有助于臨床疾病判斷的參考
　　新鮮血清經(jīng)電泳后可精確地描繪出患者蛋白質(zhì)的全貌，一般常見的是白蛋白降低、某個球蛋白區(qū)域升高，提示不同的臨床意義。如急性炎 癥時，可見a1，a2區(qū)百分率升高；腎病綜合征、慢性腎小球腎炎時呈現(xiàn)白蛋白下降，a2球蛋白升高，β球蛋白也升高；缺鐵性貧血時可由于轉(zhuǎn) 鐵蛋白的升高而呈現(xiàn)β區(qū)帶增高，而慢性肝病或肝硬變呈現(xiàn)白蛋白顯著降低，r球蛋白升高2-3倍，示免疫球蛋白多克隆增高，甚至可見β-r融 合的橋連現(xiàn)象，還可在r區(qū)呈現(xiàn)細(xì)而密的寡克隆區(qū)帶；對單一克隆漿細(xì)胞異常增殖所產(chǎn)生的無抗體活性均一的免疫球蛋白稱M蛋白的檢測，血清 蛋白電泳是其******的實(shí)驗(yàn)診斷方法?？稍陔娪緟^(qū)帶的a2-r區(qū)呈現(xiàn)致密而深染，高度集中的蛋白克隆增生區(qū)帶，稱其為m蛋白區(qū)帶，掃描后形成高 而狹窄的單株峰，若些峰在r區(qū)其峰高與峰底寬之比>2：1，而由于正常免疫球蛋白合成限制造成背景染色淺。由M蛋白所導(dǎo)致的一組疾病如：多 發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、重鏈病、游離輕鏈病、半分子病、良性單株丙球血癥和雙M蛋白血癥等，目前這類疾病已不屬罕見。血清蛋白電泳 對這類疾病的早期診斷，療效觀察和預(yù)后判斷均有十分重要的意義。
　　二、電泳技術(shù)與免疫技術(shù)相結(jié)合，大大擴(kuò)大了其臨床應(yīng)用的范圍
　　讓電流來加速抗原與抗體的擴(kuò)散并規(guī)定其運(yùn)行方向、從而加快了沉淀反應(yīng)速度。免疫電泳技術(shù)的種子類很多，如：對流免疫電泳（CIEP） 、火箭免疫電泳（RIE）、電免疫擴(kuò)散（EID）。在種免疫電泳方法牟基礎(chǔ)上，又不斷地派生出一些新的技術(shù)，如：免疫電泳（IEP）技術(shù)，1969 年Alper與Johnson推薦免疫固定電泳（IFE）是一種包括瓊脂糖凝膠蛋白電泳和免疫沉淀兩個過程的操作，是免疫沉淀反應(yīng)的一種混合技術(shù)，檢 測標(biāo)本可以是血清、尿、腦脊液或其他體液。1976年血清免疫固定電泳（IF）技術(shù)再次被推薦，用于M蛋白的分型。血清蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝介質(zhì) 上經(jīng)電泳分離后，應(yīng)用固定劑和各型免疫球蛋白及輕鏈抗血清，加于凝膠表面的泳道上，經(jīng)孵育讓固定劑和抗血清的在凝膠內(nèi)滲透并擴(kuò)散后， 若有對應(yīng)的原存在，則在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)染色后蛋白質(zhì)電泳參考泳道和抗原抗體沉淀區(qū)帶被氨基黑著色，根據(jù)電泳移動距離 分離出單克隆組分，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型。該技術(shù)的優(yōu)勢是敏感性達(dá)50-150mg/dl，操作周期短，僅需數(shù)小時，分辨率高 ，結(jié)果易于分析。現(xiàn)常用于M蛋白的分型與鑒定，已列入臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測工作。
　　三、電泳技術(shù)進(jìn)行同工酶譜分析，提高診斷率
　　1、血清乳酸脫氫酶同工酶（iso-LDH）：測定LDH同工酶有電泳法、離子交換柱層析法、免疫法、抑制劑法和酶切法，但迄今用得取多的仍 是瓊脂糖凝膠電泳法。經(jīng)電泳分離后要分離出五種同工酶區(qū)帶，急性必肌梗塞發(fā)病后平均6hLDH1即開始升高，LDH1/LDH2≥1為心肌損傷的陽性 決定性水平，肝癌時可見LDH5明顯升高，各區(qū)帶含量的確定，將經(jīng)電泳分離后的同工酶譜采用掃描予以定量，其精確度明顯高于用肉眼判斷。 　　2、血清肌酸激酶同工酶（ISO-CK）；電子秤測定CK和CH-MB仍是目前用于證實(shí)急性心肌梗塞的 道選指標(biāo)。近年來國內(nèi)一些單位用免疫抑制法測CK=MB，其原理為抗M亞單位的酶活性，因?yàn)檎Ｑ逯袔缀鯚oCK=BB，故將此值乘以2可以認(rèn)為 大致代表CK-MB的活性。此法簡單迅速，缺點(diǎn)是特異性差，如患者血清中存在CK-BB或者異常CK時，都將出現(xiàn)假性增高。不少作者報道異常CD-同 工酶，一條稱巨CK（Maxro-CK），它是CK-BB與免疫球蛋白的復(fù)合物，有IgG亦有IgA，在正常血清中Marco-CK僅占0.8%-1.6%.另一條稱線粒體CK （CK-MT），CK-MT是結(jié)合在肌肉、腦、肝內(nèi)的線粒體表面，可能是線粒體膜的碎片，在正常血清中CK-MT是不出現(xiàn)的，在心梗時亦不出現(xiàn)，只有 當(dāng)組織極度損傷，由于線粒體和細(xì)胞壁極度破壞，方可在血清中檢出。由于Macro-CK和不典型的CK-MT均不能被M抗體所抑制，故當(dāng)它們出現(xiàn)時 ，會導(dǎo)致CK-MB高于CK總活力的假性升高。使用電泳方法分離CK-MB，是根據(jù)CK-同工酶分子結(jié)構(gòu)不同，在電泳緩沖液中，所帶電荷各異，可以從 陰極到陽極將CK不同組份予以分離，其分別為CK-MM，CK-MB和CK-BB.電泳特點(diǎn)是當(dāng)出現(xiàn)異常2同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等，從電泳圖譜上很容易 發(fā)現(xiàn)，由掃描儀對各條酶進(jìn)行掃描，報告各條區(qū)帶所占百分比，結(jié)合總酶活力，求得區(qū)帶的酶省略定值結(jié)果。Macro-CK在CK-MM和CK-MB中間， 而CK-MT位置靠近陰極端，在CK-MM后面。這樣不會將CK-BB和各種異常同工酶誤認(rèn)為是CK-MB而誤診，也可解決CK-MB假性增高的錯誤原因所在。 為此，CK同工酶電泳是項(xiàng)非常實(shí)用的檢驗(yàn)技術(shù)，具有十分重要的臨床意義3、CK亞型同工酶：此外，CK-MB和CK-MM亞型測定常采用瓊脂糖凝膠等 電聚焦電泳或高壓電泳，由于操作比一般電泳麻煩，故常規(guī)常測定尚無法普及。目前引進(jìn)的自動電泳儀，有試劑盒提供，可作CK亞型分析，參 考值：CK-MM1（57.7±4.7）%；CK-MM2為（26.5±5.3）；CK-MM3為（15.8±2.5）%；CK-MM3/CK-MM1比值為0.28±0.05（范圍0.15-0.39），陽 性決定性水平>0.5.AMI第一天血中以MM3為主，但第二天以后則以MM1為主。采用電泳法分離CKMB，CKMB1和CKMB2在正常人血中CK-MB2極微，一 般比值近似是而非，在急性心肌梗塞后4-6hCKMB2亞型即在血循環(huán)中可被檢測到，故MB2/MB1的比例明顯升高，并早于總CK-MB片段的增高。當(dāng)心 肌梗塞緩解后此比便也逐漸下降。也可用于溶栓治療后的病情觀察。
　　四、結(jié)合酶免疫標(biāo)記抗體技術(shù)，檢測腦脊液內(nèi)寡克隆區(qū)帶
　　曾有作者報道采用二維電泳和銀染進(jìn)行CSF蛋白質(zhì)的分離與鑒定，方法繁復(fù)，耗時，現(xiàn)采用高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分離CSF中的蛋白質(zhì)， 并經(jīng)抗原和辣根過氧化物酶標(biāo)記的特異性IgG抗體進(jìn)行反應(yīng)來鑒定“寡克隆區(qū)帶”（OCB），經(jīng)此酶免疫標(biāo)記放大技術(shù)和顯色步驟，蛋白質(zhì)濃度 達(dá)31-125ul/L即可予以檢測，可使檢測靈敏度提高了100倍，這樣腦脊液無須濃縮，避免了在濃縮過程中蛋白質(zhì)的丟失?？捎糜谧C實(shí)和分辨OCB 免疫球蛋白及其型別。若在腦脊液標(biāo)本中檢出OCB，而其相應(yīng)標(biāo)本中未能檢出區(qū)帶，則為陽性，真實(shí)地反映是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)本身合成的免疫球 蛋白，具有重要臨床意義。它是一種定性檢測，在多發(fā)性硬化癥時，OCB是一個十分重要的標(biāo)志物。但須將患者血清和CSF在同一天同步進(jìn)行分 析，以認(rèn)證不同來源的免疫球蛋白。中樞合成免疫球蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的一個重要信號，主要用于診斷的鑒別診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患如 ：多發(fā)性硬化癥、癡呆、脊髓炎、付腫瘤性腦炎、神經(jīng)性梅素等。