電泳及電泳設備解析

添加時間：2016/10/5 13:57:00

電泳設備：帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳 (electrophoresis, EP)。
　　名詞解釋:
　　電泳：帶電荷的蛋白質(zhì)或核酸分子在電場中移動的現(xiàn)象
什么是電泳
　　溶液中帶電粒子（離子）在電場中移動的現(xiàn)象。利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。1937 年瑞典學者 A.W.K.蒂塞利烏斯設計制造了移動界面電泳儀 ，分離了馬血清白蛋白的3種球蛋白，創(chuàng)建了電泳技術(shù)。
　　在確定的條件下，帶電粒子在單位電場強度作用下，單位時間內(nèi)移動的距離（即遷移率）為常數(shù)，是該帶電粒子的物化特征性常數(shù)[1]。不 同帶電粒子因所帶電荷不同，或雖所帶電荷相同但荷質(zhì)比不同，在同一電場中電泳，經(jīng)一定時間后，由于移動距離不同而相互分離。分開的距 離與外加電場的電壓與電泳時間成正比。
　　在外加直流電源的作用下，膠體微粒在分散介質(zhì)里向陰極或陽極作定向移動，這種現(xiàn)象叫做電泳。利用電泳現(xiàn)象使物質(zhì)分離，這種技術(shù)也 叫做電泳。膠體有電泳現(xiàn)象，證明膠體的微粒帶有電荷。各種膠體微粒的本質(zhì)不同，它們吸附的離子不同，所以帶有不同的電荷。利用電泳可 以確定膠體微粒的電性質(zhì)，向陽極移動的膠粒帶負電荷，向陰極移動的膠粒帶正電荷。一般來講，金屬氫氧化物、金屬氧化物等膠體微粒吸附 陽離子，帶正電荷；非金屬氧化物、非金屬硫化物等膠體微粒吸附陰離子，帶負電荷。因此，在電泳實驗中，氫氧化鐵膠體微粒向陰極移動， 三硫化二砷膠體微粒向陽極移動。利用電泳可以分離帶不同電荷的溶膠。例如，陶瓷工業(yè)中用的粘土，往往帶有氧化鐵，要除去氧化鐵，可以 把粘土和水一起攪拌成懸浮液，由于粘土粒子帶負電荷，氧化鐵粒子帶正電荷，通電后在陽極附近會聚集出很純凈的粘土。工廠除塵也用到電 泳。利用電泳還可以檢出被分離物，在生化和臨床診斷方面發(fā)揮重要作用。本世紀40年代末到50年代初相繼發(fā)展利用支持物進行的電泳，如濾 紙電泳，醋酸纖維素膜電泳、瓊脂電泳；50年代末又出現(xiàn)淀粉凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳等。目前，電泳技術(shù)已廣泛應用于分析化學、生 物化學、臨床化學、藥理學、免疫學、微生物學、遺傳學等科學中。
電泳種類
　　按分離原理的不同，電泳分為 4類：移動界面電泳、區(qū)帶電泳、等電聚焦電泳和等速電泳（見圖）。
　　①移動界面電泳是將被分離的離子（如陰離子）混合物置于電泳槽的一端（如負極），在電泳開始前，樣品與載體電解質(zhì)有清晰的界面。 電泳開始后，帶電粒子向另一極（正極）移動，泳動速度快的離子走在前面，其他離子依電極速度快慢順序排列，形成不同的區(qū)帶。只有 第一個區(qū)帶的界面是清晰的，達到完全分離，其中含有電泳速度快的離子，其他大部分區(qū)帶重疊（圖a）。
　　②區(qū)帶電泳是在一定的支持物上，于均一的載體電解質(zhì)中，將樣品加在中部位置，在電場作用下，樣品中帶正或負電荷的離子分別向負或 正極以不同速度移動，分離成一個個彼此隔開的區(qū)帶（ 圖b ）。區(qū)帶電泳按支持物的物理性狀不同，又可分為紙和其他纖維膜電泳、粉末電泳 、凝膠電泳與絲線電泳。
　　③等電聚焦電泳是將兩性電解質(zhì)加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當其處在低于其本身等電點的環(huán)境中則帶正電荷，向負極移動；若其 處在高于其本身等電點的環(huán)境中，則帶負電向正極移動。當泳動到其自身特有的等電點時，其凈電荷為零，泳動速度下降到零，具有不同等電 點的物質(zhì)最后聚焦在各自等電點位置 ，形成一個個清晰的區(qū)帶（ 圖c ），分辨率極高。
　　④等速電泳是在樣品中加有領(lǐng)先離子（其遷移率比所有被分離離子的大）和終末離子（其遷移率比所有被分離離子的小），樣品加在領(lǐng)先 離子和終末離子之間，在外電場作用下，各離子進行移動，經(jīng)過一段時間電泳后，達到完全分離。被分離的各離子的區(qū)帶按遷移率大小依序排 列在領(lǐng)先離子與終末離子的區(qū)帶之間。由于沒有加入適當?shù)闹С蛛娊赓|(zhì)來載帶電流 ，所得到的區(qū)帶是相互連接的（圖d），且因“ 自身校正” 效應，界面是清晰的，這是與區(qū)帶電泳不同之處。
　　電泳分離原理示意圖 a 移動界面電泳 b 區(qū)帶電泳 c 等電聚焦電泳 d 等速電泳 L 領(lǐng)先離子 T 終末離子
應用
　　電泳已日益廣泛地應用于分析化學、生物化學、臨床化學、毒劑學、藥理學、免疫學、微生物學、食品化學等各個領(lǐng)域。在直流電場中， 帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electropho-resis）。1809年俄國物理學家Peнce首先發(fā)現(xiàn)了電泳現(xiàn)象，但直到1937年瑞 典的Tiselius建立了分離蛋白質(zhì)的界面電泳（boundary electrophoresis）之后，電泳技術(shù)才開始應用。本世紀60-70年代，當濾紙、聚丙烯酰 胺凝膠等介質(zhì)相繼引入電泳以來，電泳技術(shù)得以迅速發(fā)展。豐富多彩的電泳形式使其應用十分廣泛。電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì)的分離分析 外，主要用于蛋白質(zhì)、核酸、酶，甚至病毒與細胞的研究。由于某些電泳法設備簡單，操作方便，具有高分辨率及選擇性特點，已成為醫(yī)學 檢驗中常用的技術(shù)。
　　電泳又名 —— 電著 ( 著 ) ，泳漆，電沉積。創(chuàng)始于二十世紀六十年代，由福特汽車公司應用于汽車底漆。由于其出色的防腐、防 銹功能，很快在軍工行業(yè)得到廣泛應用。近幾年才應用到日用五金的表面處理。由于其優(yōu)良的素質(zhì)和高度環(huán)保，正在逐步替代傳統(tǒng)油漆噴涂。 　　電泳原理：
　　電泳是電泳涂料在陰陽兩極，施加于電壓作用下，帶電荷之涂料離子移動到陰極，
　　并與陰極表面所產(chǎn)生之堿性作用形成不溶解物，沉積于工件表面。
　　它包括四個過程：
　　1 ）電解（分解）
　　在陰極反應為電解反應，生成氫氣及氫氧根離子 OH ，此反應造成陰極面形成
　　一高堿性邊界層，當陽離子與氫氧根作用成為不溶于水的物質(zhì)，涂膜沉積，方程式
　　為： H2O→OH+H
　　2 ）電泳動（泳動、遷移）
　　陽離子樹脂及 H+ 在電場作用下，向陰極移動，而陰離子向陽極移動過程。
　　3 ）電沉積（析出）
　　在被涂工件表面，陽離子樹脂與陰極表面堿性作用，中和而析出不沉積物，沉
　　積于被涂工件上。
　　4 ）電滲（脫水）
　　涂料固體與工件表面上的涂膜為半透明性的，具有多數(shù)毛細孔，水被從陰極涂
　　膜中排滲出來，在電場作用下，引起涂膜脫水，而涂膜則吸附于工件表面，而
　　完成整個電泳過程。
　　? 電泳表面處理工藝的特點：
　　電泳漆膜具有涂層豐滿、均勻、平整、光滑的優(yōu)點，電泳漆膜的硬度、附著力、
　　耐腐、沖擊性能、滲透性能明顯優(yōu)于其它涂裝工藝。
　　電泳
　　電泳(Electrophoresis)是指帶電荷的粒子或分子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳.大分子的蛋白質(zhì),多肽,病毒粒子,甚至細胞或小分子的氨基 酸,核苷等在電場中都可作定向泳動.1937年Tiselius成功地研制了界面電泳儀進行血清蛋白電泳,它是在一U型管的自由溶液中進行的,電泳后用 光學系統(tǒng)使各種蛋白所形成折光率差別成為曲線圖象,將血清蛋白分為白蛋白,α1-球蛋白,α2-球蛋白,β-球蛋白和γ-球蛋白五種,隨 后,Wielamd 和Kanig 等于1948年采用濾紙條做載體,同軸電纜成功地進行了紙上電泳.從那 時起,電泳技術(shù)逐漸被人們所接受并予以重視,繼而發(fā)展以濾紙,各種纖維素粉,淀粉凝膠,瓊脂和瓊脂糖凝膠,醋酸纖維素薄膜,聚丙烯酰胺凝膠等 為載體,結(jié)合增染試劑如銀氨染色,考馬斯亮藍等大大提高和促進生物樣品著色與分辨能力,此外電泳分離和免疫反應相結(jié)合,使分辨率不斷朝著 微量和超微量(1ng～0.001ng)水平發(fā)展,從而使電泳技術(shù)獲得迅速推廣和應用.在此主要介紹常用電泳的一般原理及其應用.
　　(一)電泳的基本原理
　　生物大分子如蛋白質(zhì),核酸,多糖等大多都有陽離子和陰離子基團,稱為兩性離子.常以顆粒分散在溶液中,它們的靜電荷取決于介質(zhì)的H+濃度 或與其他大分子的相互作用.在電場中,帶電顆粒向陰極或陽極遷移,遷移的方向取決于它們帶電的符號,這種遷移現(xiàn)象即所謂電泳.
　　如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中,使顆粒具有恒定遷移速率的驅(qū)動力來自于顆粒上的有效電荷Q和電位梯度E.它們 與介質(zhì)的摩擦阻力f抗衡.在自由溶液中這種抗衡服從Stokes定律.
　　F=6πrvη
　　這里v是在介質(zhì)粘度為η中半徑為r的顆粒的移動速度.但在凝膠中,這種抗衡并不完全符合Stokes定律.F取決于介質(zhì)中的其他因子,如凝膠厚 度,顆粒大小,甚至介質(zhì)的內(nèi)滲等.
　　電泳遷移率(mbility)m規(guī)定為在電位梯度E的影響下,顆粒在時間t中的遷移距離d.
　　d
　　m= ------------ 或 m=V / E
　　t·E
　　遷移率的不同提供了從混合物中分離物質(zhì)的基礎,遷移距離正比于遷移率.
　　(二)影響電泳的因素
　　1. 電泳介質(zhì)的pH值
　　溶液的pH值決定帶電物質(zhì)的解離程度,也決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少.對蛋白質(zhì),氨基酸等類似兩性電解質(zhì),pH值離等電點越遠,粒子所帶電荷 越多,泳動速度越快,反之越慢.因此,當分離某一種混合物時,應選擇一種能擴大各種蛋白質(zhì)所帶電荷量差別的pH值,以利于各種蛋白質(zhì)的有效分 離.為了保證電泳過程中溶液的pH值恒定,必須采用緩沖溶液.
　　緩沖液的離子強度
　　溶液的離子強度(Ion intensity)是指溶液中各離子的摩爾濃度與離子價數(shù)平方的積的總和的1/2.帶電顆粒的遷移率與離子強度的平方根成 反比.低離子強度時,遷移率快,但離子強度過低,緩沖液的緩沖容量小,不易維持pH恒定.高離子強度時,遷移率慢,但電泳譜帶要比低離子強度時 細窄.通常溶液的離子強度在0.02～0.2之間.
　　I=1/2∑CiZi2 (I:離子強度;Ci:離子的摩爾濃度;Zi:離子價數(shù). )
　　0.154M NaCl溶液的離子強度為:
　　I= 1/2(0.154×12+0.154×12)=0.154
　　0.015M Na2SO4溶液的離子強度為:
　　I= 1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.045
　　3. 電場強度
　　電場強度(電勢梯度Electric field intensity)是指每厘米的電位降(電位差或電位梯度).電場強度對電泳速度起著正比作用,電場強度越 高,帶電顆粒移動速度越快.根據(jù)實驗的需要,電泳可分為兩種:一種是高壓電泳,所用電壓在500～1000V或更高.由于電壓高,電泳時間短(有的樣 品需數(shù)分鐘),適用于低分子化合物的分離,如氨基酸,無機離子,包括部分聚焦電泳分離及序列電泳的分離等.因電壓高,產(chǎn)熱量大,必須裝有冷卻 裝置,否則熱量可引起蛋白質(zhì)等物質(zhì)的變性而不能分離,還因發(fā)熱引起緩沖液中水分蒸發(fā)過多,使支持物(濾紙,薄膜或凝膠等)上離子強度增加,以 及引起虹吸現(xiàn)象(電泳槽內(nèi)液被吸到支持物上)等,都會影響物質(zhì)的分離.另一種為常壓電泳,產(chǎn)熱量小,室溫在10～25℃分離蛋白質(zhì)標本是不被破 壞的,無需冷卻裝置,一般分離時間長.
　　4. 電滲現(xiàn)象
　　在電場中液體對于一個固體的固定相相對移動稱為電滲.在有載體的電泳中,影響電泳移動的一個重要因素是電滲.常遇到的情況是γ-球 蛋白,由原點向負極移動,這就是電滲作用所引起的倒移現(xiàn)象.產(chǎn)生電滲現(xiàn)象的原因是載體中常含有可電離的基團,如濾紙中含有羥基而帶負電荷, 與濾紙相接觸的水溶液帶正電荷,液體便向負極移動.由于電滲現(xiàn)象往往與電泳同時存在,所以帶電粒子的移動距離也受電滲影響;如電泳方向與 電滲相反,則實際電泳的距離等于電泳距離加上電滲的距離.瓊脂中含有瓊脂果膠,,其中含有較多的硫酸根,所以在瓊脂電泳時電滲現(xiàn)象很明顯, 許多球蛋白均向負極移動.除去了瓊脂果膠后的瓊脂糖用作凝膠電泳時,電滲大為減弱.電滲所造成的移動距離可用不帶電的有色染料或有色葡聚 糖點在支持物的中心,以觀察電滲的方向和距離.
　　(三)電泳的分類
　　目前所采用的電泳方法,大致可分為3類:顯微電泳,自由界面電泳和區(qū)帶電泳.區(qū)帶電泳應用廣泛,區(qū)帶電泳可分為以下幾種類型:
　　按支持物的物理性狀不同,區(qū)帶電泳可分為:
　　(1)濾紙為支持物的紙電泳;
　　(2)粉末電泳: 如纖維素粉,淀粉,玻璃粉電泳;
　　(3)凝膠電泳:如瓊脂,瓊脂糖,硅膠,淀粉膠,聚丙烯酰胺凝膠電泳;
　　(4)緣線電泳:如尼龍絲,人造絲電泳
　　2. 按支持物的裝置形式不同,區(qū)帶電泳可分為:
　　(1)平板式電泳:支持物水平放置,是常用的電泳方式;
　　(2)垂直板電泳:聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳.
　　(3)柱狀(管狀)電泳:聚丙烯酰胺凝膠可灌入適當?shù)碾娪竟苤凶龀晒軤铍娪?
　　3.按pH的連續(xù)性不同,區(qū)帶電泳可分為:
　　(1)連續(xù)pH電泳:如紙電泳,醋酸纖維素薄膜電泳;
　　(2)非連續(xù)pH電泳:如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳;
　　(四)電泳所需的儀器
　　電泳所需的儀器有:電泳槽和電源.
　　1. 電泳槽
　　電泳槽是電泳系統(tǒng)的核心部分,根據(jù)電泳的原理,電泳支持物都是放在兩個緩沖液之間,電場通過電泳支持物連接兩個緩沖液,不同電泳采用 不同的電泳槽.常用的電泳槽有:
　　(1)圓盤電泳槽:有上,下兩個電泳槽和帶有鉑金電極的蓋.上槽中具有若干孔,孔不用時,用硅橡皮塞塞住.要用的孔配以可插電泳管(玻璃管) 的硅橡皮塞.電泳管的內(nèi)徑早期為5～7mm,為保證冷卻和微量化,現(xiàn)在則越來越細.
　　(2)垂直板電泳槽:垂直板電泳槽的基本原理和結(jié)構(gòu)與圓盤電泳槽基本相同.差別只在于制膠和電泳不在電泳管中,而是在塊垂直放置的平行 玻璃板中間.
　　(3)水平電泳槽:水平電泳槽的形狀各異,但結(jié)構(gòu)大致相同.一般包括電泳槽基座,冷卻板和電極.
　　電源
　　要使荷電的生物大分子在電場中泳動,必須加電場,且電泳的分辨率和電泳速度與電泳時的電參數(shù)密切相關(guān).不同的電泳技術(shù)需要不同的電壓 ,電流和功率范圍,所以選擇電源主要根據(jù)電泳技術(shù)的需要.如聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS電泳需要200～600V電壓.
　　(五)電泳技術(shù)的應用
　　1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳可用做蛋白質(zhì)純度的鑒定.聚丙烯酰胺凝膠電泳同時具有電荷效應和分子篩效應,可以將分子大小相同而帶不同數(shù)量 電荷的物質(zhì)分離開,并且還可以將帶相同數(shù)量電荷而分子大小不同的物質(zhì)分離開.其分辨率遠遠高于一般層析方法和電泳方法,可以檢出10-9～ 10-12g的樣品,且重復性好,沒有電滲作用.
　　2. SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可測定蛋白質(zhì)分子量.其原理是帶大量電荷的SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上克服了蛋白質(zhì)分子原有電荷的影響而得到 恒定的荷/質(zhì)比.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測蛋白質(zhì)分子量已經(jīng)比較成功,此法測定時間短,分辨率高,所需樣品量極少(1～100μg),但只適用于球 形或基本上呈球形的蛋白質(zhì),某些蛋白質(zhì)不易與SDS結(jié)合如木瓜蛋白酶,核糖核酸酶等,此時測定結(jié)果就不準確.
　　3. 聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于蛋白質(zhì)定量.電泳后的凝膠經(jīng)凝膠掃描儀掃描,從而給出定量的結(jié)果.凝膠掃描儀主要用于對樣品單向電泳后 的區(qū)帶和雙向電泳后的斑點進行掃描.
　　4.瓊脂或瓊脂糖凝膠免疫電泳可用于①檢查蛋白質(zhì)制劑的純度;②分析蛋白質(zhì)混合物的組分;③研究抗血清制劑中是否具有抗某種已知抗原 的抗體;④檢驗兩種抗原是否相同.
　　(六)電泳后結(jié)果檢測
　　對于不同的目的,應采用不同的檢測方法.用染料和生物大分子結(jié)合形成有色的復合物是電泳后檢測常用的方法.
　　(七)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果不正常現(xiàn)象和對策
　　1. 指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上或向下的現(xiàn)象.向上的"微笑"現(xiàn)象說明凝膠的不均勻冷卻,中間部分冷卻不好,所以導致凝膠中分子有不同的遷 移率所致.這種情況在用較厚的凝膠以及垂直電泳中時常發(fā)生.向下的"皺眉"現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時電泳槽的裝置不合適引起的,特別是當凝 膠和玻璃板組成的"三明治"底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會產(chǎn)生這種現(xiàn)象.
　　2."拖尾"現(xiàn)象是電泳中常見的現(xiàn)象.這常常是由于樣品溶解不佳引起的,克服的辦法是在加樣前離心,選用合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液 ,加增溶輔助試劑.另一方法是降低凝膠濃度.
　　3."紋理"現(xiàn)象常常是由于樣品中不溶顆粒引起的,克服辦法是增加溶解度和離心除去不溶性顆粒.
　　4. 蛋白帶偏斜常常是由于濾紙條或電極放置不平行所引起的,或由于加樣位置偏斜而引起.
　　5. 蛋白帶過寬,與鄰近蛋白泳道的蛋白帶相連,這是由于加樣量太多或加樣孔泄漏引起的.
　　6. 蛋白帶模糊不清和分辨不佳是由于多種原因引起的.雖然梯度凝膠可以提高分辨率,但與其他方法相比,常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳是分辨 率較低的方法.為了提高分辨率,不要加過多的樣品,小體積樣品可給出窄帶.加樣后應立即電泳,以防止擴散.選擇合適的凝膠濃度,使組分得以充 分的分離.通常靠近前沿的蛋白帶分辨率不佳,所以應根據(jù)分子量與凝膠孔徑的關(guān)系,灌制足夠長度的凝膠,以使樣品不會走出前沿.樣品的蛋白水 解作用也引起擴散而使分辨率降低.水解作用通常發(fā)生在樣品準備的時候,系統(tǒng)中的內(nèi)源性蛋白酶會水解樣品蛋白,如果在緩沖液中加蛋白酶抑制 劑可以減少這種情況的發(fā)生.